菌、南美白对虾、微生物群落，这三者有什么关系？

摘要
对虾生产是近几十年来第二大贸易产品，而凡纳滨对虾是第六大养殖品种。益生菌是水产养殖中促进生长和预防疾病的替代策略。为确定益生菌对不同发育阶段凡纳滨对虾幼虫发育及微生物群落的影响,五种益生菌(108~109CFU/g)被添加到虾幼虫的饲养环境, 从无节幼体阶段到后幼体阶段，研究了益生菌对细菌群落、水质、幼体生长和免疫指标的影响。结果表明，在Z1期至P5期，益生菌处理组的成活率均高于对照组。乳酸菌可以提高幼虫的生存能力，特别是在M2、M3、P1、P5期幼虫。研究证明，益生菌能促进虾幼体的生长发育，防止其生长过程中的不完全脱皮，尤其是EM处理组。结果表明，除SA处理组外，各处理组弧菌数量均有显著下降趋势。不同的益生菌对弧菌的抑制作用也不同。其中以LA、EM和PB效果最好，可提高幼虫存活率，促进幼虫变态，减少弧菌数量和NH4-N、NO2-N水平，增加细菌多样性。

研究背景
益生菌含有潜在的有益细菌，几年前被认为是有益于人体健康的膳食补充剂。前期研究证实，益生菌在抑制病原微生物、增强宿主免疫、促进其生长因子等方面发挥着重要作用，包括酶消化。

此外，益生菌被用作减少抗生素使用的辅助方法。益生菌一般分为乳酸菌、双歧杆菌和部分革兰氏阳性球菌三类，如有效微生物(EM)、芽孢杆菌(BA)、乳酸菌(LA)、光合细菌(PB)、酵母菌(SA)等。这些益生菌的有益作用包括改善生长性能，增强酶对营养的贡献，抑制消化道致病菌的粘附和定植，以及增加血液参数和免疫反应。

以前的研究报道了肠道细菌群落对于维持宿主的代谢和免疫以及躲避病毒和细菌疾病的重要性，这些通常是由海洋环境中的弧菌等优势条件致病菌引起的。而微生物的高多样性对稳定水生系统起着重要作用，包括:维持水质、改善营养、增加培养可行性和促进培养生物的健康。在宿主-微生物相互作用的研究中，常驻细菌被认为是长期影响的主要贡献者。因此，全面了解细菌群落组成和改变因素对于提高水产养殖质量至关重要。

本研究在养殖对虾幼体的水环境中添加5种益生菌(包括EM、BA、LA、PB、SA)，从无节幼体(N)阶段到后幼体(P)阶段、蚤状幼体(Z)阶段(Z1、Z2、Z3)、糠虾幼体(M)阶段(M1、M2、M3)、P1和P5，分析了益生菌对细菌群落和水质、幼体生长以及细菌群落的影响。分析了不同发育阶段凡纳滨对虾幼虫和饲养水体细菌的丰度和多样性。本研究将有助于产生对商业虾场有用的信息。

材料与方法

五种益生菌包括BA、EM、LA、PB和SA，分别在塑料桶中添加然后在塑料桶上覆盖黑色薄膜8 h以激活益生菌。凡纳滨对虾幼体从深圳基地,南海渔业研究所中国水产科学院幼虫被随机分配到一个包含300L-500L黑色塑料水桶海水的密度300无节幼虫/L。

将幼虫放入待测塑料桶前，分别在塑料桶中添加BA、EM、LA、PB、SA 5种益生菌，然后在塑料桶上覆盖黑色薄膜8h激活益生菌。同时对只含幼虫的对照组进行分析。实验组和对照组每5次平行进行。采用砂滤机过滤海水，整个实验过程中海水没有发生变化。

水温保持在31.0~32.5℃，盐度保持在28~30‰，pH值保持在7.8~8.0，对气石进行连续曝气，使溶解氧保持在5.8~6.4 mg/L。然后将所有的板放入28°C的孵化器中。与TCBS琼脂平板孵育96 h后，计数并记录细菌菌落数量。此外，还检测了氨氮(NH4-N)和亚硝酸盐(NO2-N)(参照GB17378.4-2007)。
01、幼虾在发育阶段的存活率
当幼虫到达M期时，出现粘腿现象。这是因为饲养水体中有太多的营养物质。粘腿会导致幼虫活力和摄食能力的下降。幼虫摄食能力的丧失会导致其营养不良，最终死亡。本研究表明，在Z1期至P5期，EM-、BA-和SA-处理组的成活率均高于对照组。结果表明，5种益生菌，特别是LA和PB，均能显著提高幼虫在P期的生存能力，并与出苗率有关。

02、幼虾的变态率
一般来说，在Z3~M1阶段，虾幼体会出现不完全脱壳，这将使小部分壳留在虾幼体身上，从而导致不完整的蜕变。与对照组相比，各试验组在不同发育阶段的变态率均高于对照组。由此可见，EM处理组和LA处理组在各发育阶段的变态率均显著高于对照组，其中P1期的变态率较对照组分别提高了10%和9%。结果表明，EM和LA对虾幼体的变形有明显的促进作用，有利于虾幼体的养殖。当达到P1期时，其他4种益生菌也能促进幼虫的变态。

添加益生菌后，试验组水中弧菌数量有所下降，在N6~Z1期间低于对照组。有一个显著区别LA-组和对照组,和EM-组和对照组之间。BA处理组和PB处理组弧菌数量也明显低于对照组。结果表明，EM、LA、PB和BA对饲养水中的弧菌有抑制作用，SA对弧菌无抑制作用。

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03、弧菌数量和氨氮、二氧化氮的变化


各组NH4-N和NO2-N均呈上升趋势，但未见显著增加，保持在正常范围内。添加益生菌的养殖水中NH4-N和NO2-N浓度有所降低。EM、BA和PB组在P5期NH4-N和NO2-N浓度显著低于对照组(P<0.05)。

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04、微生物的丰富性和多样性


饲养水体中物质多样性分析：N6阶段，除LA处理组外，各试验组的Shannon指数均高于对照组。到Z1阶段，PB处理组和处理组水样中的香农指数均高于对照。

到达M1阶段时，各试验组的香农指数均高于对照组。到了P1阶段细菌多样性非常大。除SA处理组外，其余试验组均明显低于对照组。而PB处理组的变化最明显，表明其外观不稳定。

分析了不同时期幼虫体内细菌的多样性。说明在相同的益生菌处理下，幼虫不同发育阶段的菌群存在差异。很明显, 与饲养水体中的Shannon指数相比，N6阶段对虾幼虫的细菌多样性明显降低。

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结果显示，与虾幼体内的微生物区系相比，养殖水环境中的微生物区系变化较大。

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05、细菌群落和关键物种的演替



对N6期至P1期幼虫体内细菌群落组成及饲养水环境进行了综合研究。在科水平上分析了主要的丰富细菌。

结果表明，从N6期到P1期，幼虫源和水源样品几乎所有样品中的优势菌都是红细菌科和黄杆菌科。水源细菌的科多样性明显高于幼虫源细菌。养殖水体中Microbacteriaceae较多，幼虫中较少。此外，可以看出，5种不同的益生菌处理后，水环境中细菌群落的主要差异是优势种比例的变化，但细菌种类基本不变。幼虫细菌种类差异较大，幼虫细菌种类较少。图可以看出，5种不同的益生菌处理后，幼虫的细菌群落没有规律性的差异。

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不同微生物处理环境和不同发育阶段的虾幼体样品共有20个恒定菌群。OTUs丰度簇的热图显示了各细菌的富集程度。大多数情况下，无论不同的益生菌处理，幼虫或饲养水环境中的细菌区系都是分开的。但在M1期，幼虫的菌群与环境中的菌群相似。M1期是食性转化的关键时期，由藻食性动物变成食肉动物。因此，细菌群变得不稳定。

结果表明，这一时期幼虫的菌群对水环境中的菌群更敏感。

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以上数据，包括弧菌存活率、变态率和数量，表明EM、LA和PB效果较好。因此，研究了不同发育阶段的特异性优势菌。这说明EM和LA处理的优势菌群相似。

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06、讨论

结果表明，在重要发育阶段，幼虫存活率与益生菌含量之间存在一定的关系。结果为正相关，说明益生菌处理组Z1期至P5期的成活率均高于对照组。数据分析表明，LA菌能提高幼虫的生存能力，与出苗率有关。这可能是因为LA菌能够促进饲养水体中过量营养物质的代谢，进一步减少粘腿现象，从而限制了虾幼体的摄食能力和活力，导致虾幼体营养不良。

益生菌能促进虾幼体的生长发育，防止虾幼体生长过程中的不完全脱壳，进一步减少发育不良和畸形的病例。本试验证了使用益生菌对虾仁脱壳的积极作用。但是不同的益生菌在幼虫蜕皮过程中的作用在本研究中尚未得到解释。

此外，还检测了弧菌数量。弧菌长期以来一直是引起贝类特别是虾类疾病的主要病原体。弧菌病之所以如此具有威胁性，是因为它们会伤害虾的外骨骼，而外骨骼是虾防御多种病因的重要和主要屏障

本试验证明不同的益生菌在不同的生命周期都能抑制弧菌的增殖。添加益生菌的养殖水NH4-N和NO2-N浓度均有所降低，这进一步证明了水生环境中益生菌的多样性对对虾尤其是幼虾的生存至关重要。

综上所述，当存在水体生物量增加的情况时，添加益生菌可以降低有机物和氨的浓度。这一过程还可以减少引起外骨骼疾病的病原体。其中LA菌、EM菌和PB菌效果最好，能提高幼虫存活率，促进幼虫变态，显著减少弧菌数量，抑制NH4-N和NO2-N水平。

因此，根据现有研究，在适当的物种丰富度和物种多样性的水生环境中，水系统更有可能是健康的，因为高细菌多样性可能与影响有机物消耗和氮化合物转化的众多生物过程有关显然，本研究表明外源益生菌对原生菌群的影响不大，但仍能保持多种菌群共存，有利于维持整个水生环境的稳定，避免幼虫的应激反应。


来源：水产设施养殖与装备工程研究中心

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