虾苗检测有哪些坑！无某种病原体，虾却死于该病原体的，真正秘密！

聚合酶链式反应(PCR)是一种非常强大的分子工具，可以检测极低水平的脱氧核糖核酸（DNA，生物的遗传密码或遗传物质)。这种方法的核心是一种能放大DNA数量的酶。PCR具有高度的敏感性和特异性，一旦鉴定出一种可能的生物(通常是细菌或病毒，尽管它可以检测到任何生物的DNA)，就对DNA进行测序，并鉴定可能是该生物特有的特定序列。




一、PCR越来越成为虾行业当中，疾病检测的重要工具


这些核苷酸(DNA的组成部分)序列构成了引物的基础。引物是反应的模板。将目标生物的DNA样本与引物混合。如果同源DNA序列存在的话，引物就会和同源DNA序列(四个碱基中的每一个碱基，是DNA的组成部分，它们互相配对)结合。PCR可用于确定病原体是否存在，即简单的“是”或“否”，而不表明存在多少病原体，或者可用于定量方式。



PCR技术彻底改变了我们对周围世界的认识。我们可以在非常低的水平上发现潜在的病原体，并通过量化感兴趣的有机体的水平如何随时间变化，来确定疾病感染是否正在发生。不幸的是，一些“伪科学”渗透到人类从事的大多数活动的方方面面，其中就包括水产养殖。PCR被广泛滥用和理解不足，这可能导致严重的问题，假阳性，假阴性，甚至混合反应，从而误导用户的判断。



与大多数化学反应一样，PCR测试的条件是严格的，即使是很小的变化也会影响结果。不恰当的控制，样品和试剂的污染，不遵守热循环要求等都会导致测试结果的不准确。这就是为什么定期进行这些测试的实验室应该由第三方审核的原因之一，以验证他们的测量确实是准确和一致的，因为PCR是非常容易出错的。

随着产业的发展，PCR在水产养殖和渔业中，越来越成为一种重要的工具。尽管有专家学者努力想办法让用户了解PCR的真正价值，但目前来看这并不是很成功的。因为大多数人都不明白这只是一种工具，而不是一种解决方案。在这里，我将讨论一些普遍存在的直接影响PCR结果的谬论。






二、PCR检测那些常见的谬论


谬论1：PCR检测的结果总是正确的


正确构建的引物是针对特定生物的。虽然预期引物序列是唯一的，如果它不是唯一的，引物可以与其他生物体的DNA产生交叉反应。通过关注那些被证实是独一无二的基因，我们就可以努力来减少这种情况。但是对于一些病原体，如传染性皮下及造血组织坏死病(IHHNV)的病原体，这并非易事。众所周知，虾将病毒DNA片段整合到它们的基因组(所有遗传物质)中。



引物序列必须指向与感染相一致的DNA序列，而不是与宿主的基因组结合。聚合酶链反应技术(PCR)的特点是可以设计引物序列，而这些引物序列在其他任何生物体中都找不到。也就是说，交叉反应导致误导性数据的出现。尽管很多机构都运行了适当的控制来确保这种情况不会发生，但这并不意味着这种情况不会发生。

在IHHNV的情况下，如果我们寻找含有可传播病毒的携带者，我们必须确保引物序列与发现病毒一致，而不是与非感染性包涵体一致。这就是很多人，将同一池虾苗，送至两个检测站，得到检测结果不一样的一个重要原因。



谬论2：使用PCR技术，可以适应于广泛疾病检测


这项技术被广泛用于测试较为广泛的疾病检测，但是如果只检测少数样品，它可能会导致结果出现错误。因此，它最适合于检测个体，以确定携带状态和可能导致急性疾病的特定生物体的存在。



一个很好的例子就是检测是否存在引起白斑综合症病毒(WSSV)的病毒。这种疾病的主要传播途径是通过携带者进行传播。亲虾携带病毒并将其传给虾苗(PL)，后者又将病毒带入养殖环境当中。对于大多数高毒性病原体，虾对其耐受性为零，因此它特别危险。如果它们存在，并且条件符合病毒扩散的条件，那么只需要极少数(甚至一个)病毒携带者，就可以大面积传播病毒。



美国渔业协会出版了关于鱼类健康的蓝皮书，以帮助养殖户应对可能影响他们的无数疾病问题。它为总体抽样提供了统计基础。不幸的是，这些不适合用于对虾，因为高繁殖率可以使得50万或更多的卵产自一对亲虾。



在养殖户把虾苗送检时，抽样是随机的，就算是检测结果百分之百的准确。但在数量众多的虾苗中抽取少量的样品，最大的准确率只是98%，这意味着2%的虾苗仍然可能携带病原体。在一百万尾虾中，可能有两万尾还携带着病原体，而PCR检测告诉你什么病原体也没有。



许多公司会定期检测亲虾和虾苗的一些病原体，通常是世界动物卫生组织(OIE)规定的常见病原体。由于进行PCR检测的成本和缺乏监管，通常只对一小部分样本进行检测，这最终导致养殖户也会拿到带病虾苗。



谬论3：PCR适用于检测任何病原体



并非所有的病原体都存在于虾的组织器官中，同时，如果感染程度很低，那么对已知病原体的目标组织进行取样就很重要。此外，对于一些病原体，仅仅采集样本是不够的。再次以WSSV为例，这种病毒在31摄氏度以上的水温下复制能力非常差。在大多数情况下，除非存在严重的压力源和明显的感染证据，否则温水中动物体内保存的病毒载量太低，无法通过PCR检测。



即使当检测人员关注了目标组织时，病毒也可能处于休眠状态，要找到它就像大海捞针一样困难。所以，被测试的虾需要放置在适应病毒爆发的条件下，比如：将水温逐渐降低到20摄氏度左右，并放置几天，这是使用PCR检测时，确保无WSSV病毒的唯一方法。如果没有这样做，就不能说检测出相关的样品没有WSSV。事实上，在许多情况下，当WSSV病毒处于休眠状态时，PCR检测不到WSSV，这导致养殖户拿苗后，爆发大规模的WSSV疾病。



谬论4：可以用PCR来确定一个种群是SPF（无特定病源）级的


无特定病原体(SPF)的概念很重要。如果从字面上理解这个定义，那就意味着某一特定的病原体不存在于被测试的样品中。然而，如果人们所做的是蓝皮书级别的测试，那么在没有一些特别的背景下，就不应该认为该种群是SPF级的。

PCR本身不能将某一种群称为SPF。SPF是一个过程，而不是某一组样品，进行有限检测而得出的结果。除了在适当的条件下，单独测试每组样品之外，唯一能确定一个种群是SPF级的方法是通过它们的历史生长数据。很多亲虾公司，都在宣称，自家的亲虾属于SPF级的，但是很多养殖户发现自己的虾正是死于该病原体，这是很多情况是亲虾携带该病原体直接导致的结果。





三、正确的理解PCR，对于养殖的意义重大


如果使用正确，PCR检测是一种有价值的工具。一个积极的结果很重要，而一个消极的结果就不那么重要了。在一个大群体的样本中出现的一个阴性结果，加上没有后续跟踪和缺乏适当设计的繁殖计划，可能会导致养殖户遇上一场灾难，不幸的是，它已经并将继续这样做。这并不意味着聚合酶链反应(PCR)没有价值，而是仅仅依赖于它，并不符合充分的生物安全水平，以及也不能让虾产业走上真正、可持续性的发展道路。

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