中国太平洋牡蛎(Crassostrea Gigas)夏季大规模死亡的病原菌

2019年8月，中国山东养殖的太平洋牡蛎暴发大规模死亡，死亡率高达60%。从濒临死亡的牡蛎中分离出致病菌，并对其中一株革兰氏阴性杆状细菌进行了进一步鉴定，将其命名为Cg5。根据16S rRNA系统发育分析和生化特征，确定Cg5为溶藻弧菌。将溶藻弧菌注射到健康牡蛎体内，表现出与自然感染牡蛎相同的症状和组织病理学变化。对该菌株在不同温度下的生长能力进行了分析，结果表明，高温有利于病原菌的增殖。这些结果表明，高温可以促进溶藻弧菌的生长和致病性，表明夏季高温诱导了病害的爆发。此外，在溶藻弧菌中还检测到了aspa、胶原酶(Collagenase)、flb、fur、ompW、tlh和toxR等重要毒力基因，进一步支持了其较强的致病性。这是我国首次报道溶藻弧菌是能够引起太平洋牡蛎夏季大量死亡的病原菌，为我国牡蛎的病害监测和遗传育种提供了有价值的信息。



实验结果：

1、牡蛎发病症状与病原菌筛选

对于自然患病的牡蛎，贝壳和软组织没有明显的损伤，但散发出刺鼻的气味。内收肌收缩变慢，不能完全闭合壳层。用TCBS培养基检测弧菌，光镜下未发现寄生虫，病牡蛎中未扩增出OsHV-1 基因片段。将患病牡蛎的无菌组织悬浮液注射到健康牡蛎中，没有导致死亡，这表明没有其他病毒存在。

2、弧菌Cg5菌株的生化特性研究

进一步分析了弧菌Cg5的生化特性。Cg5在TCBS琼脂上孵育12h，呈淡黄色，圆形湿润，中心隆起，边缘整齐。革兰氏染色显示，Cg5为杆状、形态均一的革兰氏阴性细菌。因为它可以利用蔗糖，所以在TCBS平板上形成了黄色菌落(图1)，这与副溶血性弧菌形成的绿色菌落不同。

                               
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图1 溶藻弧菌Cg5在TCBS琼脂平板上的菌落形态

表1给出了Cg5的表型特征。泳动试验表明，Cg5是一种可移动的细菌。voges-proskauer试验(VP)、吲哚、葡萄糖、甘露糖、赖氨酸脱羧酶、O/129(10μg)、O/129(150μg)阳性。在盐度为3%、6%、8%和10%NaCl的条件下，在20◦C、30◦C、35◦C的温度下均能生长。3%NaCl和35◦C是Cg5生长的最适盐度和温度。

表1 经鉴定的溶藻弧菌Cg5的表型特征

                               
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3、基于16S rRNA的系统发育分析

溶藻弧菌Cg5的16S rRNA序列已登录NCBI数据库，登录号为MW295458。16S rRNA测序和BLAST分析表明，本研究中的Cg5与公共数据库中的溶藻弧菌的同源性在99%以上。根据弧菌16S rRNA基因序列构建系统发育树。进一步验证了本研究中分离到的菌株Cg5为溶藻弧菌(图2)。

                               
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图2基于16S rRNA的弧菌系统发育分析



4、Cg5在不同温度条件下的生长试验

Cg5在高温下表现出显著的生长优势(20◦C、25◦C vs 15◦C)。在15◦C、20◦C和25◦C下测得菌落直径分别为1.32mm、2.2mm和2.83mm(图3A)。Cg5在25◦C下的生长明显快于20◦C和15◦C下的生长，生长曲线表明15◦C的低温对Cg5的生长有明显的抑制作用(图3B)。

                               
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图3 A. Cg5在不同温度下的生长试验(**P

                               
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图4. 牡蛎肌肉注射溶藻弧菌后在不同温度下的存活曲线

6、组织学变化

在注射分离的溶藻弧菌Cg5的牡蛎中，观察到与自然发病的牡蛎相同的症状。组织学上，注射Cg5后，牡蛎的消化腺明显受损(图5)。消化腺管增大，吸收细胞萎缩，伴有脂褐素积聚和结缔组织坏死(图5B)。在所有自然患病牡蛎中观察到相同的组织学改变(图5C)，而在健康牡蛎中没有观察到类似的损伤(图5A)。

                               
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图5.不同条件下牡蛎的病理观察。

A.健康牡蛎消化腺的HE染色。B.注射Cg5后牡蛎消化腺HE染色。C.在大规模死亡暴发期间采集的牡蛎消化腺的HE染色。→表现为脂褐素积聚，☆表现为消化小管增大，∆表现为结缔组织坏死，⇨表现为吸收细胞萎缩。


7、抗生素敏感性试验

Cg5菌株对青霉素、苯唑西林、氨苄青霉素、羧苄青霉素、哌拉西林、头孢氨苄、头孢曲松、诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、万古霉素、麦迪霉素、红霉素、土霉素、四环素、新诺比星、利福平耐药(R)；对头孢美嗪、头孢拉定、头孢呋辛、头孢哌酮、环丙沙星、多粘菌素B中度敏感(M)；对头孢他啶、复方磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、呋喃唑酮、链霉素、庆大霉素、氯霉素敏感(S)。

                               
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表2 溶藻弧菌药敏图谱分析



8、毒力基因的PCR检测

所测的7个毒力基因(aspa、胶原酶、flb、fur、ompW、tlh和toxR)均从Cg5中检测到。

                               
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图6. 溶藻弧菌Cg5毒力基因的特异性PCR扩增

M：DL2000 DNAMarker记。1: aspa; 2:Collagenase; 3: flb; 4: fu; 5: ompW; 6: tlh; 7: toxR。

9、水温对疾病暴发的影响

从公共数据平台(http://mds.nmdis.org.cn/)检索山东沿海地区的年水温记录。根据图7，发病月份的平均水温高于25◦C，其他月份的水温低于20◦C。本研究设计的15◦C、20◦C和25◦C的水温数据代表了不同季节的水温，以说明温度对疾病爆发的影响。

                               
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图7.山东省2019年沿海地区年水温。7、8、9月的水温在25◦C(红条)以上。

总结：

本研究调查了我国牡蛎大规模死亡的致病因素。结果表明，从发病牡蛎中分离到的溶藻弧菌Cg5对牡蛎具有较强的致病性，感染Cg5的牡蛎表现出与自然感染牡蛎相同的症状和组织病理学变化。温度显著影响溶藻弧菌致死牡蛎的能力，表明温度是引起疾病暴发的关键环境因子。此外，在分离的溶藻弧菌中均检测到7个毒力基因，进一步证实了其潜在的致病性。据了解，溶藻弧菌是导致我国养殖牡蛎夏季大量死亡的病原菌，属首次报道。这些结果将为牡蛎的疾病监测和遗传育种提供有价值的信息，以培育出高抗病性的牡蛎品系。

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